[P1-3-20] Changes in stimulus responsiveness of parotid secretory granules over time
Keywords:分泌顆粒、外分泌腺、唾液タンパク質
【目的】唾液腺腺房細胞は唾液タンパク質を合成後，分泌顆粒に貯蔵する。分泌顆粒内のタンパク質は刺激により分泌されるが，分泌が抑制された状態が続くと，分泌顆粒が細胞内に貯留する。長期間細胞内に貯留した分泌顆粒は，品質が低下し組織障害を引き起こす可能性がある。組織恒常性を維持するためにも，古くなった分泌顆粒は適切に処理されなければならない。そこで本研究では，分泌顆粒の品質管理機構を明らかにするために，分泌顆粒の時間経過による刺激反応性を解析した。
【方法】ラット耳下腺から単離した初代腺房細胞に，唾液タンパク質であるシスタチンD (Cst5) と蛍光リガンド結合タンパク質 Halo-Tag の融合タンパク質 Cst5-Halo を発現させた。 HaloTag TMR リガンドで標識後，余剰リガンドを除去して 3 時間培養した後に，β アゴニストであるイソプロテレノールを存在下及び非存在下でインキュベートし細胞と培地を回収した。細胞溶解液と培地を HaloTag AlexaFluor 660 (AF660) リガンドで標識後，電気泳動を行い PVDF 膜に転写した。蛍光画像撮影後，分泌顆粒の細胞内貯留量および分泌量を測定して，分泌された Cst5-Halo の割合を算出した。
【結果と考察】AF660 および TMR で標識された Cst5-Halo は，共にイソプロテレノール添加の方が無添加よりも分泌される割合が高かった。また，AF660 で標識された方が， TMR で標識されたよりもイソプロテレノール添加によって増加する割合が有意に高かった。これらのことより，新しい分泌顆粒の方が古い分泌顆粒よりも，刺激反応性が高いことが示唆される。
【利益相反】利益相反状態にはありません。
【方法】ラット耳下腺から単離した初代腺房細胞に，唾液タンパク質であるシスタチンD (Cst5) と蛍光リガンド結合タンパク質 Halo-Tag の融合タンパク質 Cst5-Halo を発現させた。 HaloTag TMR リガンドで標識後，余剰リガンドを除去して 3 時間培養した後に，β アゴニストであるイソプロテレノールを存在下及び非存在下でインキュベートし細胞と培地を回収した。細胞溶解液と培地を HaloTag AlexaFluor 660 (AF660) リガンドで標識後，電気泳動を行い PVDF 膜に転写した。蛍光画像撮影後，分泌顆粒の細胞内貯留量および分泌量を測定して，分泌された Cst5-Halo の割合を算出した。
【結果と考察】AF660 および TMR で標識された Cst5-Halo は，共にイソプロテレノール添加の方が無添加よりも分泌される割合が高かった。また，AF660 で標識された方が， TMR で標識されたよりもイソプロテレノール添加によって増加する割合が有意に高かった。これらのことより，新しい分泌顆粒の方が古い分泌顆粒よりも，刺激反応性が高いことが示唆される。
【利益相反】利益相反状態にはありません。