[P2-3-18] Generation of mouse models for human disease by i-GONAD method and application of high-resolution Melt analysis for rapid screening and genotyping
Keywords:ゲノム編集、i-GONAD法、高解像度融解曲線（HRM）解析
これまでに我々は、CRSPR-Cas9ゲノム編集法とエレクトロポレーション法を組み合わせたマウス作製法（In vitro electroporation法、i-GONAD法）を用いて、35遺伝子、50系統を超えるヒト疾患モデルマウスおよびラット（Takabayashi, Sci. Rep.2018, Aoto, Int. J. Mol. Sci. 2022）を作製し、ヒト疾患原因遺伝子の機能解析を行ってきた（Aoto, Nat. Comm.2021, Mutoh, J. Neuro. Res. 2022）。
今回脳の海馬で発現し、記憶・学習に関わり、知的障害と発達遅滞を示す患者でde novo変異を同定した（Akita*, Aoto*, Ann. Cli. Transl. Neurol. 2018）、II型カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素（CaMKIIα、CaMKIIβ）について、AlphaFold2によるタグ挿入位置としてタンパク質構造予想の後、i-GONAD法によりFlagタグの挿入マウスを作製した。これらのマウスでは、市販の抗体で免疫組織染色、ウェスタン・ブロット、免疫沈降法が行えるため、特異抗体のない標的タンパク質の解析に有効と考えられる。
また、ゲノム編集による動物・細胞モデルの作製や解析において、置換やインデルの選別や遺伝子判定は必須のステップである。そこで、作製した疾患モデルマウス・細胞の未知変異の迅速な選別と既知変異の遺伝子判定のためのhigh-resolution Melting (Melt) PCRを確立した。この方法は、gRNA選別、一塩基多型（SNP）のチェック、マウスの遺伝子型判定、編集用細胞株の選別とクローニングに活用でき、迅速（2時間以内）、高感度で、コスト効率の高い、1塩基以上の違いを見分けられる方法である。
今回脳の海馬で発現し、記憶・学習に関わり、知的障害と発達遅滞を示す患者でde novo変異を同定した（Akita*, Aoto*, Ann. Cli. Transl. Neurol. 2018）、II型カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素（CaMKIIα、CaMKIIβ）について、AlphaFold2によるタグ挿入位置としてタンパク質構造予想の後、i-GONAD法によりFlagタグの挿入マウスを作製した。これらのマウスでは、市販の抗体で免疫組織染色、ウェスタン・ブロット、免疫沈降法が行えるため、特異抗体のない標的タンパク質の解析に有効と考えられる。
また、ゲノム編集による動物・細胞モデルの作製や解析において、置換やインデルの選別や遺伝子判定は必須のステップである。そこで、作製した疾患モデルマウス・細胞の未知変異の迅速な選別と既知変異の遺伝子判定のためのhigh-resolution Melting (Melt) PCRを確立した。この方法は、gRNA選別、一塩基多型（SNP）のチェック、マウスの遺伝子型判定、編集用細胞株の選別とクローニングに活用でき、迅速（2時間以内）、高感度で、コスト効率の高い、1塩基以上の違いを見分けられる方法である。