[0847] 線条体出血モデルラットの機能回復過程におけるNogo-Aタンパク発現について
キーワード：線条体出血, Nogo-A, 樹状突起
【はじめに,目的】
我々は,線条体出血モデルラットを用いて脳損傷後の運動療法の効果およびその作用メカニズムの解析を行っている。これまで,線条体出血により,直接的に損傷を受けていない大脳皮質の神経細胞が二次的に変性され,樹状突起の退縮が認められることを報告した。さらに,線条体出血後早期からトレッドミル運動を行うことにより運動機能回復が促進し,大脳皮質運動野における樹状突起の退縮が抑制されることを示した。これらのことから,線条体出血後のトレッドミル運動は出血に引き続いて生じる神経細胞樹状突起の変性に対して何らかの作用を及ぼし,運動機能回復を促進させたと結論づけた。しかし,その詳細なメカニズムについては未だ不明な点が多い。Nogo-Aタンパクは軸索伸展阻害因子であり,脳虚血モデルラットに対する抗Nogo-A療法により運動機能回復と樹状突起の伸展が生じることが報告されている。このことからNogo-Aが脳損傷後の樹状突起の形態学的変化に作用していると考えられる。しかし,線条体出血モデルにおけるNogo-Aの発現やトレッドミル運動による影響に関する報告はない。これらを明らかにする研究の第一段階として,線条体出血後のNogo-Aの発現について報告する。
【方法】
実験動物にはWistar系雄性ラット（8週齢）を用いた。深麻酔下にて左線条体にコラゲナーゼ（Type IV）を1.2 μl注入し,線条体出血モデル（以下ICH群）を作成した。偽手術群（以下sham群）には同様の手順で1.2 μlの生理食塩水を注入した。運動機能評価にはmotor deficit score（MDS）,beam walking test,forelimb asymmetry testを用いた。評価は手術前,手術後1,3,7,10,15日目に実施した（sham群n=5,ICH群n=6）。手術後15日目,0.9%生理食塩水で脱血,4%パラホルムアルデヒド溶液で灌流固定を実施し,脳を摘出した。40 μmの脳切片を作成し,Nogo-A免疫組織化学染色を行い,Nogo-Aの発現領域の同定と大脳皮質におけるNogo-A陽性細胞数のカウントを行った（sham群,ICH群それぞれn=3）。
【倫理的配慮,説明と同意】
動物愛護の観点より，使用匹数を必要最小限にとどめるよう配慮し，全ての処置は名古屋大学医学部保健学科動物実験委員会の承認を得て実施した。
【結果】
運動機能テスト（MDS,beam walking test,forelimb asymmetry test）により,ICH群は出血翌日より前肢および後肢に運動麻痺を呈していることが示され,15日目までその運動麻痺の残存を示した（MDS,beam walking test：P＜0.05）。一方,Forelimb asymmetry testでは出血15日目においてICH群とsham群に差がない程度にまで回復がみられた。組織学的解析では,sham群,ICH群ともに,Nogo-A陽性細胞が大脳皮質,線条体,海馬など広い範囲で観察できた。群間を比較すると,ICH群ではsham群に比べて強い染色性を示していた。さらに,ICH群では線維状に染色されている像が多く観察された。大脳皮質運動野における単位面積あたりのNogo-A陽性細胞数はICH群でsham群より有意に多かった（P＜0.05）。
【考察】
正常な脳組織（sham群）においてもNogo-A陽性細胞は脳内の広い領域で観察されたが,線条体出血後15日間経過した組織ではNogo-A陽性細胞の増加傾向がみられた。さらに,線条体出血後には,大脳皮質において線維状のNogo-A陽性像が確認できたが,これは形態学的に判断すると神経細胞樹状突起と考えられる。これまで我々が報告した線条体出血後に生じる大脳皮質の神経細胞樹状突起の変性に関する結果を踏まえると,本研究の結果は樹状突起の変性に成長抑制因子の一つであるNogo-Aが関与している可能性を示唆していると考えられる。しかし,本研究において今回観察されたNogo-Aが神経細胞であるとは断定する事はできておらず,今後神経細胞マーカーとの二重染色による検証などを進める必要があると考えられる。
【理学療法学研究としての意義】
本研究は,線条体出血後に大脳皮質で生じる遅発的な神経細胞の変性メカニズムの一端を示しており,中枢神経系疾患の病態理解に寄与している。今後,運動療法による効果を検討する事で,科学的根拠に基づいた理学療法の実践に繋がると考えられる。
我々は,線条体出血モデルラットを用いて脳損傷後の運動療法の効果およびその作用メカニズムの解析を行っている。これまで,線条体出血により,直接的に損傷を受けていない大脳皮質の神経細胞が二次的に変性され,樹状突起の退縮が認められることを報告した。さらに,線条体出血後早期からトレッドミル運動を行うことにより運動機能回復が促進し,大脳皮質運動野における樹状突起の退縮が抑制されることを示した。これらのことから,線条体出血後のトレッドミル運動は出血に引き続いて生じる神経細胞樹状突起の変性に対して何らかの作用を及ぼし,運動機能回復を促進させたと結論づけた。しかし,その詳細なメカニズムについては未だ不明な点が多い。Nogo-Aタンパクは軸索伸展阻害因子であり,脳虚血モデルラットに対する抗Nogo-A療法により運動機能回復と樹状突起の伸展が生じることが報告されている。このことからNogo-Aが脳損傷後の樹状突起の形態学的変化に作用していると考えられる。しかし,線条体出血モデルにおけるNogo-Aの発現やトレッドミル運動による影響に関する報告はない。これらを明らかにする研究の第一段階として,線条体出血後のNogo-Aの発現について報告する。
【方法】
実験動物にはWistar系雄性ラット（8週齢）を用いた。深麻酔下にて左線条体にコラゲナーゼ（Type IV）を1.2 μl注入し,線条体出血モデル（以下ICH群）を作成した。偽手術群（以下sham群）には同様の手順で1.2 μlの生理食塩水を注入した。運動機能評価にはmotor deficit score（MDS）,beam walking test,forelimb asymmetry testを用いた。評価は手術前,手術後1,3,7,10,15日目に実施した（sham群n=5,ICH群n=6）。手術後15日目,0.9%生理食塩水で脱血,4%パラホルムアルデヒド溶液で灌流固定を実施し,脳を摘出した。40 μmの脳切片を作成し,Nogo-A免疫組織化学染色を行い,Nogo-Aの発現領域の同定と大脳皮質におけるNogo-A陽性細胞数のカウントを行った（sham群,ICH群それぞれn=3）。
【倫理的配慮,説明と同意】
動物愛護の観点より，使用匹数を必要最小限にとどめるよう配慮し，全ての処置は名古屋大学医学部保健学科動物実験委員会の承認を得て実施した。
【結果】
運動機能テスト（MDS,beam walking test,forelimb asymmetry test）により,ICH群は出血翌日より前肢および後肢に運動麻痺を呈していることが示され,15日目までその運動麻痺の残存を示した（MDS,beam walking test：P＜0.05）。一方,Forelimb asymmetry testでは出血15日目においてICH群とsham群に差がない程度にまで回復がみられた。組織学的解析では,sham群,ICH群ともに,Nogo-A陽性細胞が大脳皮質,線条体,海馬など広い範囲で観察できた。群間を比較すると,ICH群ではsham群に比べて強い染色性を示していた。さらに,ICH群では線維状に染色されている像が多く観察された。大脳皮質運動野における単位面積あたりのNogo-A陽性細胞数はICH群でsham群より有意に多かった（P＜0.05）。
【考察】
正常な脳組織（sham群）においてもNogo-A陽性細胞は脳内の広い領域で観察されたが,線条体出血後15日間経過した組織ではNogo-A陽性細胞の増加傾向がみられた。さらに,線条体出血後には,大脳皮質において線維状のNogo-A陽性像が確認できたが,これは形態学的に判断すると神経細胞樹状突起と考えられる。これまで我々が報告した線条体出血後に生じる大脳皮質の神経細胞樹状突起の変性に関する結果を踏まえると,本研究の結果は樹状突起の変性に成長抑制因子の一つであるNogo-Aが関与している可能性を示唆していると考えられる。しかし,本研究において今回観察されたNogo-Aが神経細胞であるとは断定する事はできておらず,今後神経細胞マーカーとの二重染色による検証などを進める必要があると考えられる。
【理学療法学研究としての意義】
本研究は,線条体出血後に大脳皮質で生じる遅発的な神経細胞の変性メカニズムの一端を示しており,中枢神経系疾患の病態理解に寄与している。今後,運動療法による効果を検討する事で,科学的根拠に基づいた理学療法の実践に繋がると考えられる。