[O-0518] 経皮的末梢神経電気刺激（TENS）がマウス神経障害性疼痛モデルの脊髄後角二次ニューロンに及ぼす影響
Keywords:経皮的末梢神経電気刺激（TENS）, 神経障害性疼痛, 脊髄後角二次ニューロン
【はじめに，目的】
神経障害性疼痛の主症状である痛覚過敏の発症や持続には，脊髄後角内でのmicrogliaやastorcytesといったグリア細胞が活性化し，グリア細胞から炎症性サイトカインの放出が放出され，脊髄後角表層に存在する痛覚を伝達する二次ニューロンの感受性を亢進させる事が近年明らかにされてきている。このような神経障害性疼痛による痛覚過敏に対して臨床的に経皮的末梢神経電気刺激（transcutaneous electrical nerve stimulation；TENS）が行われているが，その鎮痛効果の基礎的メカニズムは未解明な点が多い。これらの事を背景に我々は，マウス神経障害性疼痛モデルを用いてTENSの鎮痛効果およびそのメカニズムについて基礎的な解析を継続的に行い，これまでにTENS治療は痛覚過敏の改善と脊髄後角におけるmicrogliaとastrocytesの活性化を抑制させる事を報告した。さらにTENS治療が神経障害性疼痛による痛覚過敏を抑制する事の証明には，痛覚を伝達する二次ニューロンの感受性を評価，検討する事が必要と考えられる。神経障害性疼痛では，脊髄後角表層に分布する痛覚伝達に関与する二次ニューロン内でγ isoform of protein kinase C（PKC-γ）やphospho-cyclic AMP response element-binding protein（p-CREB）といった蛋白が，細胞内の情報を伝達する分子の活性化や受容体の発現および活性化に関与し，感受性を変化させる事が明らかにされている。しかしながら，TENS治療が神経障害性疼痛の一つの病態である二次ニューロン内でのこれらの蛋白発現にどのように影響しているかは不明である。
本研究ではマウス神経障害性疼痛モデルを使用し，TENS治療が脊髄後角表層における二次ニューロンの感受性亢進に関与する蛋白に及ぼす影響について免疫組織化学的に検証した。
【方法】
対象はICRマウス（9週齢，n=15）とした。マウス神経障害性疼痛モデルとして総腓骨神経，脛骨神経を結紮後に切断し，腓腹神経を温存するspared nerve injury（SNI）を行い，障害側を左側とした。マウスをSNI群，SNI後1日目からTENS治療を行うTENS群，SNI手術のSham手術として神経までを展開し閉創するSham群に群分けした。TENS治療は，電気刺激装置（Pulsecure-Pro KR-7；OG技研社製）を使用し，刺激部位は左側のL1-L6に感覚支配される左側の傍脊柱筋の直上の皮膚，周波数は100Hz，刺激強度は筋収縮が生じない最大強度，刺激時間は30分間とし，麻酔下にて1日1回実施した。7日間のTENSの後，灌流固定を行い，L4-5の脊髄を採取し，20μmに薄切し，神経細胞のマーカーであるNeuN，痛覚感受性の亢進に関連する蛋白であるPKC-γとp-CREBについてそれぞれ免疫染色を行った。解析対象を脊髄後角表層とし，NeuNとPKC-γとp-CREBの二重染色による神経細胞におけるそれぞれの蛋白の分布を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。さらに，核染色であるDAPIと共染色されるPKC-γ陽性細胞およびp-CREB陽性細胞の細胞数をカウントした。群間の比較には，一元配置分散分析の後，post hoc testとしてBonferroniの多重比較を行い，有意水準を5%とした。
【結果】
全ての群においてNeuNと共染色されるPKC-γ陽性ニューロンとp-CREB陽性ニューロンが観察されたが，SNI群で増加している傾向を示した。細胞数の定量化では，SNI群は，Sham群と比較して有意にPKC-γ陽性ニューロンとp-CREB陽性ニューロンのどちらの細胞数も増加していた（p＜0.05）。一方，TENS群は，SNI群と比較し，PKC-γ陽性ニューロンとp-CREB陽性ニューロンのどちらの細胞数も有意に減少していた（p＜0.05）。
【考察】
本研究では，TENS治療により二次ニューロンの感受性に関連すると報告されている蛋白発現の減少を認めた。TENS治療は，先行研究で報告した脊髄後角内のmicrogliaとastrocytesの活性化を抑制させるのに加え，神経障害性疼痛の病態の一つである二次ニューロンの感受性の亢進に抑制的に作用している事が確認でき，鎮痛効果が得られるための基盤となる二次ニューロンの変化ではないかと推察された。
【理学療法学研究としての意義】
これまでTENS治療が，神経障害性疼痛の病態である脊髄後角内のmicrogliaとastrocytesの活性化に及ぼす影響について報告してきたが，一次求心性神経からの痛覚情報の脳への伝達が主な機能である二次ニューロンの変化については未検討であった。本研究は，TENS治療により二次ニューロンの感受性の亢進が抑制される事が確認しており，神経障害性疼痛に対するTENSによる鎮痛効果の基礎メカニズムの一部を解明できたと考えている。
神経障害性疼痛の主症状である痛覚過敏の発症や持続には，脊髄後角内でのmicrogliaやastorcytesといったグリア細胞が活性化し，グリア細胞から炎症性サイトカインの放出が放出され，脊髄後角表層に存在する痛覚を伝達する二次ニューロンの感受性を亢進させる事が近年明らかにされてきている。このような神経障害性疼痛による痛覚過敏に対して臨床的に経皮的末梢神経電気刺激（transcutaneous electrical nerve stimulation；TENS）が行われているが，その鎮痛効果の基礎的メカニズムは未解明な点が多い。これらの事を背景に我々は，マウス神経障害性疼痛モデルを用いてTENSの鎮痛効果およびそのメカニズムについて基礎的な解析を継続的に行い，これまでにTENS治療は痛覚過敏の改善と脊髄後角におけるmicrogliaとastrocytesの活性化を抑制させる事を報告した。さらにTENS治療が神経障害性疼痛による痛覚過敏を抑制する事の証明には，痛覚を伝達する二次ニューロンの感受性を評価，検討する事が必要と考えられる。神経障害性疼痛では，脊髄後角表層に分布する痛覚伝達に関与する二次ニューロン内でγ isoform of protein kinase C（PKC-γ）やphospho-cyclic AMP response element-binding protein（p-CREB）といった蛋白が，細胞内の情報を伝達する分子の活性化や受容体の発現および活性化に関与し，感受性を変化させる事が明らかにされている。しかしながら，TENS治療が神経障害性疼痛の一つの病態である二次ニューロン内でのこれらの蛋白発現にどのように影響しているかは不明である。
本研究ではマウス神経障害性疼痛モデルを使用し，TENS治療が脊髄後角表層における二次ニューロンの感受性亢進に関与する蛋白に及ぼす影響について免疫組織化学的に検証した。
【方法】
対象はICRマウス（9週齢，n=15）とした。マウス神経障害性疼痛モデルとして総腓骨神経，脛骨神経を結紮後に切断し，腓腹神経を温存するspared nerve injury（SNI）を行い，障害側を左側とした。マウスをSNI群，SNI後1日目からTENS治療を行うTENS群，SNI手術のSham手術として神経までを展開し閉創するSham群に群分けした。TENS治療は，電気刺激装置（Pulsecure-Pro KR-7；OG技研社製）を使用し，刺激部位は左側のL1-L6に感覚支配される左側の傍脊柱筋の直上の皮膚，周波数は100Hz，刺激強度は筋収縮が生じない最大強度，刺激時間は30分間とし，麻酔下にて1日1回実施した。7日間のTENSの後，灌流固定を行い，L4-5の脊髄を採取し，20μmに薄切し，神経細胞のマーカーであるNeuN，痛覚感受性の亢進に関連する蛋白であるPKC-γとp-CREBについてそれぞれ免疫染色を行った。解析対象を脊髄後角表層とし，NeuNとPKC-γとp-CREBの二重染色による神経細胞におけるそれぞれの蛋白の分布を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。さらに，核染色であるDAPIと共染色されるPKC-γ陽性細胞およびp-CREB陽性細胞の細胞数をカウントした。群間の比較には，一元配置分散分析の後，post hoc testとしてBonferroniの多重比較を行い，有意水準を5%とした。
【結果】
全ての群においてNeuNと共染色されるPKC-γ陽性ニューロンとp-CREB陽性ニューロンが観察されたが，SNI群で増加している傾向を示した。細胞数の定量化では，SNI群は，Sham群と比較して有意にPKC-γ陽性ニューロンとp-CREB陽性ニューロンのどちらの細胞数も増加していた（p＜0.05）。一方，TENS群は，SNI群と比較し，PKC-γ陽性ニューロンとp-CREB陽性ニューロンのどちらの細胞数も有意に減少していた（p＜0.05）。
【考察】
本研究では，TENS治療により二次ニューロンの感受性に関連すると報告されている蛋白発現の減少を認めた。TENS治療は，先行研究で報告した脊髄後角内のmicrogliaとastrocytesの活性化を抑制させるのに加え，神経障害性疼痛の病態の一つである二次ニューロンの感受性の亢進に抑制的に作用している事が確認でき，鎮痛効果が得られるための基盤となる二次ニューロンの変化ではないかと推察された。
【理学療法学研究としての意義】
これまでTENS治療が，神経障害性疼痛の病態である脊髄後角内のmicrogliaとastrocytesの活性化に及ぼす影響について報告してきたが，一次求心性神経からの痛覚情報の脳への伝達が主な機能である二次ニューロンの変化については未検討であった。本研究は，TENS治療により二次ニューロンの感受性の亢進が抑制される事が確認しており，神経障害性疼痛に対するTENSによる鎮痛効果の基礎メカニズムの一部を解明できたと考えている。