[P3-B-0912] 骨軟骨欠損モデルラットに対する間葉系間質細胞移植と低出力超音波パルス治療の併用による骨軟骨再生効果の検討
Keywords:関節軟骨, 再生, 低出力超音波療法
【はじめに，目的】
関節軟骨は自己再生能力に乏しい組織であり，その再生治療として培養軟骨細胞や間葉系間質細胞（MSC）を用いた細胞移植が注目されている。しかし移植後の物理療法などのリハビリテーションの有効性や安全性については十分に検討されていない。今後，細胞治療が臨床にて適用されるにあたり，再生治療における物理療法やリハビリテーションの有効性を明らかにしていくことは重要な研究課題である。近年，骨折治療で用いられる低出力超音波パルス（LIPUS）を照射することにより軟骨細胞の代謝やMSCの骨・軟骨分化に影響を及ぼすことがin vitro研究にて報告されており，今回我々は骨軟骨欠損した膝関節へのMSC移植後にLIPUSを併用することでin vivoにおいても移植したMSCを刺激し，損傷した骨軟骨の再生を促すのではないかとの仮説を設けた。本報告は細胞治療とLIPUSの併用が骨軟骨欠損の再生に影響を及ぼすかを検討したものである。
【方法】
8週齢雄性Wistar系ラット12匹の両側大腿骨滑車部に直径1mmの骨軟骨欠損を作成し4週間自由飼育した。その後，全てのラットに対して同種骨髄由来MSC 1.0×106個を右膝関節に注入し，左膝関節には対照群としてリン酸緩衝液を注入した。そして6匹ずつLIPUS照射群と非照射群に分け，対照群，LIPUS群，MSC群，LIPUS+MSC（MSCL）群の4群（各群n=3）を設けた。LIPUS群およびMSCL群には週5回，1日20分間の照射を骨折治療ですでに用いられている設定（周波数1.5MHz，繰り返し周波数1kHz，パルス幅200μ秒，空間平均時間平均強度30mW/cm2）にて行った。介入開始から4，8週後に欠損部の組織切片を作成し，サフラニンO（SO）染色，HE染色および抗II型コラーゲンの免疫組織化学染色を用いて組織を観察した。さらにWakitaniの軟骨修復スコアを用いて修復度合いを数値化し，平均±95%信頼区間にて表示した。スコアは値が低いほど良好な再生を示す。
【結果】
介入4週間後，各群のスコアは，対照群：8.7±2.36，LIPUS群：4.7±1.31，MSC群：4.7±1.31，MSCL群：4.3±0.65となった。組織観察において対照群では修復組織のSO染色性は深層の細胞周囲に限局し，表層から中間層の多くで線維軟骨様の細胞が観察され，組織表面に軽度から中等度の亀裂が観察された。LIPUS，MSCおよびMSCL群では硝子軟骨様の細胞が多く含まれるようになり，SO染色性も中間層において確認された。また修復組織の厚さも対照群に比べて厚くなっていたが，組織表面に亀裂が観察された。対照群とMSC群において軟骨下骨に軟骨様の組織が侵入している所見が一部見られた。II型コラーゲンの発現は，対照群では深層の一部のみに限局していたが，LIPUS群では修復組織の広範囲において確認できた。MSC群においては表層から中間層で発現の低下が見られた。MSCL群ではLIPUS群同様，修復組織の広範囲で確認できた。介入8週後では各群のスコアは，対照群：7.7±2.36，LIPUS群：7.0±1.96，MSC群：4.7±1.31，MSCL群：4.0±0.00となりLIPUS群で4週に比べてスコアが悪化していた。組織観察では対照群とLIPUS群では線維軟骨様の細胞が多く観察され，修復組織のSO染色性は大きく減弱していた。MSCとMSCL群では硝子軟骨様の細胞が多く観察されていたものの，染色性は大きく減弱していた。MSC群においてのみ軟骨下骨に軟骨様の組織が侵入している所見が一部で見られた。II型コラーゲンの組織観察の結果，対照群では表層から中間層で発現が低下しており，LIPUS，MSC，MSCL群では全層において発現が見られるか，表層での発現の低下が確認された。
【考察】
介入4週後においてLIPUSは欠損した関節軟骨の修復を促す可能性が示唆された。しかし介入8週後になるとLIPUS群の修復した関節軟骨は劣化しており，骨軟骨欠損に対するLIPUS照射は短期的には効果的だが，修復した軟骨は長期的には維持されないことが示唆された。MSC群の修復した関節軟骨はスコアが保たれていたが，MSC注入とLIPUSの併用は，軟骨修復スコアにおいてはMSC単独の効果と比べてほとんど差が認められなかった。今回の研究条件においてはMSC関節内注入とLIPUS照射の併用による再生への相乗効果は軟骨に対しては限定的である可能性が示唆された。しかし，併用することによりMSC群で見られた軟骨下骨への軟骨様組織の侵入が見られなかったことから，軟骨下骨に対して影響をおよぼす可能性が期待される。本報告は予備実験の段階における結果であり，今回の結果を基に，今後サンプル数およびLIPUS強度などの設定を検討していく必要がある。
【理学療法学研究としての意義】
本研究結果は骨軟骨欠損に対する細胞治療において，物理療法のひとつであるLIPUSの併用が軟骨下骨へ影響を及ぼし，骨軟骨再生に有効である可能性を示唆した。
関節軟骨は自己再生能力に乏しい組織であり，その再生治療として培養軟骨細胞や間葉系間質細胞（MSC）を用いた細胞移植が注目されている。しかし移植後の物理療法などのリハビリテーションの有効性や安全性については十分に検討されていない。今後，細胞治療が臨床にて適用されるにあたり，再生治療における物理療法やリハビリテーションの有効性を明らかにしていくことは重要な研究課題である。近年，骨折治療で用いられる低出力超音波パルス（LIPUS）を照射することにより軟骨細胞の代謝やMSCの骨・軟骨分化に影響を及ぼすことがin vitro研究にて報告されており，今回我々は骨軟骨欠損した膝関節へのMSC移植後にLIPUSを併用することでin vivoにおいても移植したMSCを刺激し，損傷した骨軟骨の再生を促すのではないかとの仮説を設けた。本報告は細胞治療とLIPUSの併用が骨軟骨欠損の再生に影響を及ぼすかを検討したものである。
【方法】
8週齢雄性Wistar系ラット12匹の両側大腿骨滑車部に直径1mmの骨軟骨欠損を作成し4週間自由飼育した。その後，全てのラットに対して同種骨髄由来MSC 1.0×106個を右膝関節に注入し，左膝関節には対照群としてリン酸緩衝液を注入した。そして6匹ずつLIPUS照射群と非照射群に分け，対照群，LIPUS群，MSC群，LIPUS+MSC（MSCL）群の4群（各群n=3）を設けた。LIPUS群およびMSCL群には週5回，1日20分間の照射を骨折治療ですでに用いられている設定（周波数1.5MHz，繰り返し周波数1kHz，パルス幅200μ秒，空間平均時間平均強度30mW/cm2）にて行った。介入開始から4，8週後に欠損部の組織切片を作成し，サフラニンO（SO）染色，HE染色および抗II型コラーゲンの免疫組織化学染色を用いて組織を観察した。さらにWakitaniの軟骨修復スコアを用いて修復度合いを数値化し，平均±95%信頼区間にて表示した。スコアは値が低いほど良好な再生を示す。
【結果】
介入4週間後，各群のスコアは，対照群：8.7±2.36，LIPUS群：4.7±1.31，MSC群：4.7±1.31，MSCL群：4.3±0.65となった。組織観察において対照群では修復組織のSO染色性は深層の細胞周囲に限局し，表層から中間層の多くで線維軟骨様の細胞が観察され，組織表面に軽度から中等度の亀裂が観察された。LIPUS，MSCおよびMSCL群では硝子軟骨様の細胞が多く含まれるようになり，SO染色性も中間層において確認された。また修復組織の厚さも対照群に比べて厚くなっていたが，組織表面に亀裂が観察された。対照群とMSC群において軟骨下骨に軟骨様の組織が侵入している所見が一部見られた。II型コラーゲンの発現は，対照群では深層の一部のみに限局していたが，LIPUS群では修復組織の広範囲において確認できた。MSC群においては表層から中間層で発現の低下が見られた。MSCL群ではLIPUS群同様，修復組織の広範囲で確認できた。介入8週後では各群のスコアは，対照群：7.7±2.36，LIPUS群：7.0±1.96，MSC群：4.7±1.31，MSCL群：4.0±0.00となりLIPUS群で4週に比べてスコアが悪化していた。組織観察では対照群とLIPUS群では線維軟骨様の細胞が多く観察され，修復組織のSO染色性は大きく減弱していた。MSCとMSCL群では硝子軟骨様の細胞が多く観察されていたものの，染色性は大きく減弱していた。MSC群においてのみ軟骨下骨に軟骨様の組織が侵入している所見が一部で見られた。II型コラーゲンの組織観察の結果，対照群では表層から中間層で発現が低下しており，LIPUS，MSC，MSCL群では全層において発現が見られるか，表層での発現の低下が確認された。
【考察】
介入4週後においてLIPUSは欠損した関節軟骨の修復を促す可能性が示唆された。しかし介入8週後になるとLIPUS群の修復した関節軟骨は劣化しており，骨軟骨欠損に対するLIPUS照射は短期的には効果的だが，修復した軟骨は長期的には維持されないことが示唆された。MSC群の修復した関節軟骨はスコアが保たれていたが，MSC注入とLIPUSの併用は，軟骨修復スコアにおいてはMSC単独の効果と比べてほとんど差が認められなかった。今回の研究条件においてはMSC関節内注入とLIPUS照射の併用による再生への相乗効果は軟骨に対しては限定的である可能性が示唆された。しかし，併用することによりMSC群で見られた軟骨下骨への軟骨様組織の侵入が見られなかったことから，軟骨下骨に対して影響をおよぼす可能性が期待される。本報告は予備実験の段階における結果であり，今回の結果を基に，今後サンプル数およびLIPUS強度などの設定を検討していく必要がある。
【理学療法学研究としての意義】
本研究結果は骨軟骨欠損に対する細胞治療において，物理療法のひとつであるLIPUSの併用が軟骨下骨へ影響を及ぼし，骨軟骨再生に有効である可能性を示唆した。