[P29-38] 単為発生胚を用いたCRISPR/Cas9・エレクトロポレーション法によるブタゲノム編集条件の検討
【目的】ゲノム編集技術は目的とする遺伝子を効率的にノックアウト，ノックインすることができる技術である．本研究では，ブタ単為発生胚を用いてCRISPR/Cas9・エレクトロポレーション法によるゲノム編集の条件について検討した．【材料と方法】細胞接着分子CADM1遺伝子のExon1およびExon4に対応するcrRNAを設計し，gRNA /Cas9nuclease複合体を調製した．ブタ卵巣から採取した未成熟卵母細胞を48時間成熟培養し，直流電気刺激により活性化を行い，3，6および９時間後に，gRNA /Cas9nuclease複合体をエレクトロポレーション法により導入した．ゲノム編集胚は活性化後６～７日間培養し，胚盤胞に発生した胚のシーケンスを解析しゲノム編集の有無を確認した．【結果】ゲノム編集効率は，Exon1（82.4％；14/17）で，Exon4（52.6%; 10/19）に比べ高くなった(P<0.05)．エレクトロポレーションの実施時間による差はなく，全体のゲノム編集率は66.7％（24/36）であった．以上の結果から，単為発生胚によりcrRNAの有効性が確認できること，活性化刺激3～9時間後にエレクトロポレーション法を実施することによりgRNA /Cas9nuclease複合体を導入してゲノム編集できることが明らかとなった．