3. Reproduction/Reproductive technology

[P3-29] ウシCKT-1細胞における効率的な遺伝子導入条件の検討

〇Kosuke Murata¹, Tugumi Iwasaki¹, Ena Nakatsukasa³, Meiko Kawamura³, Kenji Sakimura³, Manabu Abe³, Hideaki Yamashiro² (1.Graduate School of Science and Technology Niigata Univ., 2.Niigata Univ., 3.Brain Research Institute Niigata Univ.)

[目的]我々は、ウシ遺伝子改変技術開発の一環として、未分化幹細胞の樹立を進めている。その過程で、ウシ由来細胞に薬剤選択を用いて遺伝子導入を行う必要がある。同一組織由来の細胞でも動物種により利用できる選択薬剤と効率よく外部遺伝子を発現できるプロモーターは異なっているので、ウシに適した選択薬剤とプロモーターの検討を株化細胞で行った。[方法]蛍光タンパクtdTomato遺伝子をCAG及びEF1プロモーターに継ぎ、その下流にそれぞれpgkプロモーター制御下にネオマイシン (neo)とピューロマイシン(puro) 耐性遺伝子を発現するカセットを配置させた。ウシ腎臓由来細胞(CKT-1)をE-MEM、10％FBSで培養し、リポフェクション法を用いて環状及び直線化したベクターを導入した。薬剤選択は24時間後からneo(0, 0.5, 1 mg /ml)、Puro(0, 1, 2 mg /ml)でおこなった。[結果]一過性発現では、CAGプロモーターの方が導入初期から強い蛍光が認められ、EF1プロモーターより効率が良かった。一方、選択薬剤に関しては、CKT-1細胞はneo耐性が高く、1 mg/mlでも十分な選択ができなかった。Puroでは、1.0 mg /ml　48時間で完全に選択ができた。これらのことから、ウシCKT-1細胞では、CAGプロモーターを用いてPuroで選択する事が適していることが明らかになった。