[ODP6B] b. Toxins, Effectors, and Bioactive Substances

[ODP-123] Cellular Uptake of Clostridium botulinum C2 Toxin Requires Protease Activity

○Keiko Kobayashi, Anna Oka, Masaya Takehara, Masahiro Nagahama (Dept. Microbiol., Fac. Pharm. Sci., Tokushima Bunri Univ.)

【目的】C型ボツリヌス菌のC2毒素は，細胞内侵入時にCa²⁺流入によりリソソームのエキソサイトーシスが促進され，酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASMase）が遊離しエンドサイトーシスが開始し細胞内に侵入する。今回，C2毒素の細胞内侵入を明らかにするため，本毒素侵入時に遊離するリソソーム内のプロテアーゼの役割について検討した。
【方法と結果】C2毒素の侵入にリソソームから遊離するプロテアーゼが関与するかどうかを検討すると，プロテアーゼ阻害剤カクテル（PIカクテル），システインプロテアーゼ阻害剤E-64はC2毒素のラウンディング活性を抑制した。次にC2毒素処理により細胞外に遊離するプロテアーゼを蛍光基質分解活性で測定すると，C2毒素の処理濃度に依存して培地中のカテプシンBとLの活性が上昇した。この本毒素によるカテプシン活性の上昇は，PIカクテルとE-64により抑制された。さらに，C2毒素処理した細胞内のカテプシン量を測定すると，細胞内のカテプシンBとLの減少が認められた。次に，C2毒素の細胞内侵入を蛍光抗体法で観察すると，プロテアーゼ阻害剤未処理の細胞では細胞内に毒素の侵入が認められたが，細胞毒性を抑制したPIカクテルとE-64処理では本毒素の侵入が抑制された。
【考察】C2毒素は細胞膜上でオリゴマーを形成し，細胞内にCa²⁺を流入させリソソームのエキソサイトーシスによりASMase遊離を誘導する。細胞外に遊離したASMaseはカテプシンBとLで活性化され，その結果，ASMaseがSMを分解し，細胞膜上にセラミドが生成する。セラミドによる細胞膜の局所の陥入が起こり，本毒素がエンドサイトーシスにより，細胞内に侵入することが判明した。