シンポジウム4
先天性心疾患の発生と幹細胞医学

[I-S04-02] Single Cell cDNAと次世代シークエンサーを用いた心筋前駆細胞特異的表面マーカーの同定

^○石田 秀和^1,2, 小垣 滋豊², 大薗 恵一², 八代 健太¹ (1.ロンドン大学クイーンメアリー校　ウイリアムハーベイ研究所,　2.大阪大学大学院医学系研究科　小児科学)

キーワード：心筋前駆細胞, ES細胞, CRISPR/Cas9

(背景)
心臓の初期発生において、側板中胚葉から心筋系統への運命決定のタイミングやメカニズム、心筋前駆細胞の細胞生物学的特徴には未だ不明な点が多い。その理由の一つとして心筋前駆細胞特異的表面マーカーが存在しないことが挙げられる。もしそれが同定されれば、心筋前駆細胞のみを識別・単離することでより詳細な解析を行う事が可能になるとともに、心不全患者に対しiPS細胞由来の心筋前駆細胞を用いた細胞移植治療への応用も視野に入る。
(方法と結果)
我々はまず、マウス7.5日胚の心臓前駆領域を顕微鏡下で剥離したのち酵素処理し、得られた単一細胞からsingle cell cDNAライブラリーを作成した。この中で転写因子Tbx5とNkx2.5を発現している心筋前駆細胞のcDNAを選択し、次世代シークエンサーを用いて網羅的発現プロファイルを取得、心筋前駆細胞で発現が上昇している細胞表面蛋白CSA11（仮称）を同定した。マウス初期胚のWhole mount in situ hybridizationと免疫組織染色にてCSA11は心臓前駆領域に発現しており、マウスES細胞からの心筋分化誘導系においても、自己拍動開始直前に一過性の発現ピークを認めた。さらにfluorescence activated cell sorting (FACS) を用いて心筋分化途上のマウスES細胞からCSA11陽性細胞を収集した所、高率に心筋細胞へと分化する事を確認した。次にCRISPR/Cas9システムを用いてCSA11とそのファミリー蛋白のダブルノックアウト(DKO) ES細胞、さらにDKOマウス胚を作成した所、心筋細胞分化が著しく抑制されており、CSA11は心筋分化において重要な役割を果している事が明らかになった。また、ヒトES/iPS細胞を用いた心筋分化誘導系においてもCSA11は発現しており、ヒト心筋前駆細胞をFACSで単離して培養できる事が明らかとなった。
(結論)
CSA11は心筋細胞分化に重要な役割を果たすとともに、マウスおよびヒトにおいて、心筋前駆細胞表面マーカーとして利用できる。