[O-KS-12-1] 均質な関節軟骨領域を求めて
―物理的刺激効果検証に用いる関節軟骨部位の検討―
Keywords:関節軟骨, 物理的刺激, 弾性率
【はじめに，目的】
物理的刺激は関節軟骨変性の悪化，予防，改善すべてに関与し得ることから，関節軟骨に対する物理的刺激効果の詳細解明が求められている。しかし，ヒトにおける非侵襲的な関節軟骨の評価方法は確立されていない。これまでブタをはじめとした大動物の関節軟骨を摘出して生体外で培養する器官培養モデルが用いられてきたが，関節軟骨はその存在部位によって弾性率などの機械的特性が異なることが知られている。よって，種々の物理的刺激効果を検討する実験の再現性と効率性を高めるためには，均質な性状を持った関節軟骨をより多く採取することが必要となるが，どの部位を用いるのが最適なのかは明らかにされていない。本研究の目的は，ブタの大腿骨を用い，部位ごとにおける関節軟骨の弾性率を調べることで器官培養モデルとして適切な関節軟骨部位を提示すること，さらにこのモデルを用いて圧縮負荷による軟骨細胞生存性に与える影響について検証することとした。
【方法】
食肉用に販売されているブタ後肢を5膝購入し，3膝を弾性率解析に，2膝を圧縮負荷解析に用いた。3膝の大腿骨関節軟骨における6領域26部位（滑車部内側および外側領域（各5部位），内側顆部および外側顆部領域（各6部位），膝蓋骨内側および外側領域（各2部位））から関節軟骨をプラグ状に採取し，圧縮試験機を用いて1mm/minのストロークで圧縮することで弾性率を算出した。さらに滑車部においては関節軟骨厚を計測した。圧縮負荷解析では，滑車部外側領域の関節軟骨プラグを採取し，圧縮試験機を用いて0，10，20，30，40MPaの圧縮負荷を10分間持続的に負荷した（各3プラグ）。負荷終了から1時間静置後にカルセインAMにより生細胞数を，エチジウムホモダイマーにより死細胞数を計測し，細胞生存率を算出した。統計学的有意水準は5％とした。
【結果】
弾性率を6領域間で比較すると，外側顆部領域は滑車部領域および膝蓋骨領域と比較して有意に低値を示した（P＜0.05）。また，内側および外側顆部領域の荷重部位と非荷重部位を比較すると，内側顆部領域の荷重部位において有意に高かった（P＜0.01）。滑車部領域の部位間での比較では，弾性率に有意差は認められなかった。しかし，関節軟骨厚は滑車部内側においては近位部から遠位部に向かって薄くなっていったが，滑車部外側における変化はわずかであった。圧縮負荷による細胞生存率は，30MPaから表層より低下しはじめ，40MPaでは半数を下回った（細胞生存率：0MPa 85.5%±1.76，10MPa 81.2%±3.67，20MPa 83.9%±3.28，30MPa 74.7%±10.77，40MPa 43.3%±15.78）。
【結論】
ブタ関節軟骨器官培養モデルには，弾性率および関節軟骨厚の部位差が少ない大腿骨滑車部の外側領域を用いることが推奨された。また，この領域を用いた圧縮負荷による細胞生存率の解析では，10分間の30MPa負荷から細胞死が生じはじめ，40MPaでは半数以上が細胞死することが明らかとなった。
物理的刺激は関節軟骨変性の悪化，予防，改善すべてに関与し得ることから，関節軟骨に対する物理的刺激効果の詳細解明が求められている。しかし，ヒトにおける非侵襲的な関節軟骨の評価方法は確立されていない。これまでブタをはじめとした大動物の関節軟骨を摘出して生体外で培養する器官培養モデルが用いられてきたが，関節軟骨はその存在部位によって弾性率などの機械的特性が異なることが知られている。よって，種々の物理的刺激効果を検討する実験の再現性と効率性を高めるためには，均質な性状を持った関節軟骨をより多く採取することが必要となるが，どの部位を用いるのが最適なのかは明らかにされていない。本研究の目的は，ブタの大腿骨を用い，部位ごとにおける関節軟骨の弾性率を調べることで器官培養モデルとして適切な関節軟骨部位を提示すること，さらにこのモデルを用いて圧縮負荷による軟骨細胞生存性に与える影響について検証することとした。
【方法】
食肉用に販売されているブタ後肢を5膝購入し，3膝を弾性率解析に，2膝を圧縮負荷解析に用いた。3膝の大腿骨関節軟骨における6領域26部位（滑車部内側および外側領域（各5部位），内側顆部および外側顆部領域（各6部位），膝蓋骨内側および外側領域（各2部位））から関節軟骨をプラグ状に採取し，圧縮試験機を用いて1mm/minのストロークで圧縮することで弾性率を算出した。さらに滑車部においては関節軟骨厚を計測した。圧縮負荷解析では，滑車部外側領域の関節軟骨プラグを採取し，圧縮試験機を用いて0，10，20，30，40MPaの圧縮負荷を10分間持続的に負荷した（各3プラグ）。負荷終了から1時間静置後にカルセインAMにより生細胞数を，エチジウムホモダイマーにより死細胞数を計測し，細胞生存率を算出した。統計学的有意水準は5％とした。
【結果】
弾性率を6領域間で比較すると，外側顆部領域は滑車部領域および膝蓋骨領域と比較して有意に低値を示した（P＜0.05）。また，内側および外側顆部領域の荷重部位と非荷重部位を比較すると，内側顆部領域の荷重部位において有意に高かった（P＜0.01）。滑車部領域の部位間での比較では，弾性率に有意差は認められなかった。しかし，関節軟骨厚は滑車部内側においては近位部から遠位部に向かって薄くなっていったが，滑車部外側における変化はわずかであった。圧縮負荷による細胞生存率は，30MPaから表層より低下しはじめ，40MPaでは半数を下回った（細胞生存率：0MPa 85.5%±1.76，10MPa 81.2%±3.67，20MPa 83.9%±3.28，30MPa 74.7%±10.77，40MPa 43.3%±15.78）。
【結論】
ブタ関節軟骨器官培養モデルには，弾性率および関節軟骨厚の部位差が少ない大腿骨滑車部の外側領域を用いることが推奨された。また，この領域を用いた圧縮負荷による細胞生存率の解析では，10分間の30MPa負荷から細胞死が生じはじめ，40MPaでは半数以上が細胞死することが明らかとなった。