[P-KS-36-3] グルコース濃度・インスリン濃度の差異がC2C12細胞の増殖と分化に与える影響
キーワード：C2C12細胞, グルコース, インスリン
【はじめに，目的】
C2C12細胞はマウスの横紋筋細胞で，In Vitroにおける骨格筋分化実験での使用頻度は高く，その培養方法は，Katherineらにより，World Protocolも確立されている。近年では，糖尿病における骨格筋の変性は，TypeII線維に偏るなど，糖負荷による様々な骨格筋の退行変性を示す論文が報告される中，筋芽細胞の増殖と分化に着目した報告は無い。よって本研究は，筋芽細胞の増殖，分化において，培養環境中のGlucose濃度の差異やInsulin濃度の差異が与える影響を明らかにする事である。
【方法】
培養細胞はC2C12細胞（マウス横紋筋細胞）を使用した。通常培養条件は，ダルベッコフォークド改変イーグル最小培地（DMEM）に10％FBSを加えた培地を使用し，CO2インキュベーターの温度は37℃，CO2濃度は5％にて培養を行った。Glucose濃度別分化培養実験と，Glucose濃度一定でのInsulin濃度別分化培養実験を行った。
（実験1）Glucose濃度別の培地は，DMEMのGlucose濃度別の4群を作成した。Glucose濃度は，0mg/L，1000mg/L，2250mg/L，4500mg/Lとした。各群にC2C12細胞を均等に分配し，分配時の細胞数をCDA1000Bにて均等化も確認した。各Dishに1mg/mlの濃度のInsulinを10μl投与し，分化培養を行った。6日後に写真撮影と細胞計数を行い，変化を観察し，回収した。
（実験2）Insulin濃度別分化培養としては，実験1でGlucose4500mg/Lが増殖・分化培養ともに有意な成績を認めた為，Glucose4500mg/Lで培地を統一し，C2C12細胞を4Dish作成した。そこに濃度別に希釈したInsulinを10μl添加した。Insulin濃度は，0mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/mlとした。6日後に写真撮影と細胞計数を行い，回収した。その後NP-40，またRIPA BUFFERでのタンパク質の抽出を行い，ミオシン軽鎖1のELISA法を行った。ELISA KITはCOSBIO社製MYL1を使用した。
【結果】
（実験1）細胞数：細胞分配時1807.6±149/ml 培養終了後，0mg/L群38.3±4/ml，1000mg/L群31.6±3/ml，2250mg/L群408±20.3/ml，4500mg/L群2554±46.4/mlであった。顕微鏡像では，4500mg/L群のみ細胞数も多く，分化も認められ，十分に増殖・分化が見られた。
（実験2）細胞数：細胞分配時4056/ml 培養終了後，0mg/ml群9692/ml，0.25mg/ml群11523/ml，0.5mg/ml群11659/ml，1mg/ml群11799/mlであり，顕微鏡像でも細胞形質の差は無かった。NP-40抽出タンパクでのミオシン軽鎖1ELISA法では，0mg/ml群1.57，0.25mg/ml群13.5，0.5mg/ml群13.6，1mg/ml群1.15となり，RIPA BUFFERでは0mg/ml群0.57，0.25mg/ml群0.62，0.5mg/ml群0.59，1mg/ml群0.8となった（検量線R＝0.899）。
【結論】
今回の結果は，C2C12細胞の増殖・分化にGlucoseが必要であり，Insulin濃度に依存して分化することが示唆された。筋芽細胞の増殖・分化において，生体内のGlucose濃度を抑制するより，Insulin濃度を増加させる必要性が示唆された。
C2C12細胞はマウスの横紋筋細胞で，In Vitroにおける骨格筋分化実験での使用頻度は高く，その培養方法は，Katherineらにより，World Protocolも確立されている。近年では，糖尿病における骨格筋の変性は，TypeII線維に偏るなど，糖負荷による様々な骨格筋の退行変性を示す論文が報告される中，筋芽細胞の増殖と分化に着目した報告は無い。よって本研究は，筋芽細胞の増殖，分化において，培養環境中のGlucose濃度の差異やInsulin濃度の差異が与える影響を明らかにする事である。
【方法】
培養細胞はC2C12細胞（マウス横紋筋細胞）を使用した。通常培養条件は，ダルベッコフォークド改変イーグル最小培地（DMEM）に10％FBSを加えた培地を使用し，CO2インキュベーターの温度は37℃，CO2濃度は5％にて培養を行った。Glucose濃度別分化培養実験と，Glucose濃度一定でのInsulin濃度別分化培養実験を行った。
（実験1）Glucose濃度別の培地は，DMEMのGlucose濃度別の4群を作成した。Glucose濃度は，0mg/L，1000mg/L，2250mg/L，4500mg/Lとした。各群にC2C12細胞を均等に分配し，分配時の細胞数をCDA1000Bにて均等化も確認した。各Dishに1mg/mlの濃度のInsulinを10μl投与し，分化培養を行った。6日後に写真撮影と細胞計数を行い，変化を観察し，回収した。
（実験2）Insulin濃度別分化培養としては，実験1でGlucose4500mg/Lが増殖・分化培養ともに有意な成績を認めた為，Glucose4500mg/Lで培地を統一し，C2C12細胞を4Dish作成した。そこに濃度別に希釈したInsulinを10μl添加した。Insulin濃度は，0mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/mlとした。6日後に写真撮影と細胞計数を行い，回収した。その後NP-40，またRIPA BUFFERでのタンパク質の抽出を行い，ミオシン軽鎖1のELISA法を行った。ELISA KITはCOSBIO社製MYL1を使用した。
【結果】
（実験1）細胞数：細胞分配時1807.6±149/ml 培養終了後，0mg/L群38.3±4/ml，1000mg/L群31.6±3/ml，2250mg/L群408±20.3/ml，4500mg/L群2554±46.4/mlであった。顕微鏡像では，4500mg/L群のみ細胞数も多く，分化も認められ，十分に増殖・分化が見られた。
（実験2）細胞数：細胞分配時4056/ml 培養終了後，0mg/ml群9692/ml，0.25mg/ml群11523/ml，0.5mg/ml群11659/ml，1mg/ml群11799/mlであり，顕微鏡像でも細胞形質の差は無かった。NP-40抽出タンパクでのミオシン軽鎖1ELISA法では，0mg/ml群1.57，0.25mg/ml群13.5，0.5mg/ml群13.6，1mg/ml群1.15となり，RIPA BUFFERでは0mg/ml群0.57，0.25mg/ml群0.62，0.5mg/ml群0.59，1mg/ml群0.8となった（検量線R＝0.899）。
【結論】
今回の結果は，C2C12細胞の増殖・分化にGlucoseが必要であり，Insulin濃度に依存して分化することが示唆された。筋芽細胞の増殖・分化において，生体内のGlucose濃度を抑制するより，Insulin濃度を増加させる必要性が示唆された。