[1P-65] Thioflavin T fluorescence lifetime assay for distinguishing diverse structures of insulin amyloid fibrils
Thioflavin T (ThT) は、アミロイドに特徴的な積層β-sheet構造と結合し蛍光が増大することから、アミロイド検出に広く使われている。我々はアミロイドに結合したThTの蛍光寿命特性を詳細に研究してきた。ThTの蛍光寿命は、ThTの分子内回転の拘束状態、すなわちThTの結合状態と強く相関することから、アミロイドとの結合サイトに関するより詳しい知見が得られることが期待される。これまでの検討で、複数の蛍光寿命成分から、アミロイド線維上の複数種のThT結合サイトの存在が示唆されたが、様々な構造を持つアミロイドが共存していることに由来する可能性も指摘されていた。今回、超音波による成熟線維破砕と断片化線維用いたシーディング反応の繰り返しにより、構造的に純化させたインスリンアミロイド線維を用い、検証実験を行った。その結果、複数の寿命成分が観測され、複数種のThT結合サイトがインスリンアミロイド線維上に存在することを確認した。次に、純化に伴うアミロイド構造変化と各結合サイトの関連を評価するため、0～9回目の個々の純化段階における各寿命成分の評価を行った。ウシインスリンでは約6回まで寿命値と強度が変化することが確認され、アミロイド線維の構造変化が蛍光寿命の特性に影響することが分かった。また、ヒトインスリンとウシインスリンでの挙動の違いも見出された。これらの結果から、蛍光寿命計測によりアミロイド構造の違いを識別できる可能性が示唆された。