[2FT-2] Proteomics / Protein engineering (2P-62～2P-87)

[2P-70*] Generation of antibodies to an extracellular region of a membrane protein

^○Taichi Sumikawa¹, Makoto Nakakido^1,2, Daisuke Kuroda^1,2,3, Kouhei Tsumoto^1,2,3,4 (1.Dept. of Bioeng., Sch. of Eng., Univ. of Tokyo, 2.Dept. of Chem. Biotech., Sch. of Eng., Univ. of Tokyo, 3.Med. Dev. Dev. Reg. Res. Center, Sch. of Eng., Univ. of Tokyo, 4.Inst. of Med. Sci., Univ. of Tokyo)

トランスポーターやGPCRといった複数回膜貫通蛋白質の多くは細胞外に露出した領域が小さいことに加え，組換え蛋白質としての調製が難しいため，細胞外領域を認識する抗体取得は困難を極める。そのような抗体を取得するには，膜外に露出しているエピトープ部分のペプチド断片をキャリア蛋白質に化学結合させた複合体が免疫に用いられることが多い。しかし，得られてくる抗体は鎖状のペプチドを認識するものであり，全長の蛋白質抗原において構造をとるエピトープ部分を認識しにくい。そこで本研究では，抗体が認識する膜蛋白質の膜外領域の構造に着目し，グルコース輸送体である膜蛋白質Glut1をモデルとして細胞外領域を認識する抗体取得を目指した。まずGlut1の細胞外領域のヘリックス構造を模倣するように細胞外領域のペプチドを足場蛋白質に移植する免疫抗原を設計し，円二色性（CD）測定と分子動力学（MD）計算から，移植部分がヘリックス構造をとることを確認した。続いて，設計した免疫抗原をアルパカに免疫し，ファージディスプレイ法を用いて免疫抗原に結合する抗体クローンを取得した。水素-重水素交換質量分析（HDX-MS）を用いた解析により，取得した抗体クローンが足場蛋白質に移植したGlut1由来の部分をエピトープに持つことが示唆された。これら抗体クローンが組換え蛋白質として調製した全長Glut1と結合することを表面プラズモン共鳴法（SPR）により確認し、足場蛋白質を利用することによりGlut1の細胞外領域を認識する抗体取得に成功した。