[3P-80] Development of a ligand binding assay using the mini-G protein for mammalian olfactory receptors expressed in wheat germ cell free system
哺乳類嗅覚受容体（Olfactory receptor, OR）は、嗅覚のニオイ分子応答の基盤となるG タンパク質共役型受容体である。通常、 ORのリガンド応答解析では、OR発現培養細胞を用い、リガンド応答に伴うシグナル伝達下流で誘導されるルシフェラーゼ活性を検出する手法がとられる。しかし、この手法はORの精製タンパク質の機能解析には利用できず、汎用性のある新規ORタンパク質アッセイ手法の開発が求められている。そこで、本研究ではin vitroでの新規ORリガンド応答解析手法の確立を目的とした。ORの活性化後に起きる3量体Gタンパク質との結合に着目し、改変型Gタンパク質αサブユニットmini-Golfを利用したリコンビナントORとの相互作用解析を行い、ORのリガンド応答解析への利用の可能性を評価した。方法として、まず、高発現ORである hOR52を、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムによりリポソーム上に合成し、GFP-mini-Golfを組換え大腸菌から精製した。そして、hOR52とGFP-mini-Golfを、リポソーム上並びに可溶化状態でアゴニスト依存的な相互作用を試験した。その結果、リポソーム上に合成したhOR52への、アゴニスト依存的なGFP-mini-Golfの結合の確認に初めて成功した。また、可溶化したhOR52に対してもリガンド依存的なmini-Golfの結合を確認できた。本研究で構築したORとmini-Gタンパク質での相互作用解析法は、汎用性の高いアッセイ手法としての展開が期待できる。