Oral

[O2-E-AM1-01] Construction of a FimS random mutant library to identify the critical amino acids for the expression of Porphyromonas gingivalis FimA fimbiae

〇Haruka Iida¹, Kiyoshi Nishikawa², Takuma Satou¹, Misuzu Kawaguchi¹, Yoshiaki Hasegawa², Ken Miyazawa¹ (1. Div Orthodont, Aichi-Gakuin Univ Sch Dent, 2. Div Microbiol, Aichi-Gakuin Univ Sch Dent)

Keywords:Porphyromonas gingivalis、FimA線毛、FimSセンサー

【目的】歯周病原細菌Porphyromonas gingivalis （Pg菌）が産生する主要な病原因子FimA線毛の生合成は、二成分制御系FimS-FimRにより転写レベルで正方向に調節されている。FimSヒスチジンキナーゼはペリプラズム空間に突き出たセンサードメインを有するが、それが受容する環境シグナルは不明である。本研究ではFimSセンサー領域内でシグナル受容に必須のアミノ酸残基を網羅的に同定するため、FimSコード遺伝子fimSへランダムに変異導入したPg菌株ライブラリーの構築を試みた。【方法】ライブラリー作製にはPg菌fimS遺伝子破壊株に変異型fimSを発現ベクターで導入・相補する方式を採用した。まず校正機能を欠いたpolymeraseを用いdNTPsの濃度比率を調整したerror-prone PCRにより、fimSのセンサードメインコード域にランダムな変異を導入した。これをメガプライマーに用いて野生型fimS全長を組込んだ発現ベクターを鋳型にinverse-PCRを行い、fimS部分を変異型に置換した。鋳型ベクターをDpnIで消化後、大腸菌S17-1株へ電気穿孔法で導入して得た1,140株の形質転換体をPg菌fimS破壊株AGFSと混合培養し、接合伝達にて変異型fimS発現ベクターをAGFS株へ導入した。fimS相補株はテトラサイクリンとゲンタマイシン含有血液寒天培地で選択培養した。【結果】fimSセンサーコード領域内に導入された塩基置換数は1株当たり平均2.6箇所、それに伴うアミノ酸置換数は平均1.8箇所であった。これまでに500株以上の変異型fimS相補Pg菌株の分離に成功した。【今後の展開】各相補株が保持するfimS内変異箇所の同定とfimA転写レベルの表現型解析を並行して進め、FimS変異箇所と線毛表現型の対応付けを系統的に行う予定である。