The 142nd Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan (Nagoya)

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(C) Pharmaceutical Biology

[28PO5-am2] Biomolecules-3 Enzymes, Oxidation-reduction, Others

Mon. Mar 28, 2022 10:50 AM - 12:30 PM [Room PO5] Bldgs. 2&3, 3F Passage (Bldgs. 2&3: 3F)

10:50 AM - 12:30 PM

[28PO5-am2-03S] Identification of substrates and metabolites of orphan cytochrome P450 CYP2U1 expressed in E. coli.

○Airi Saza1, Mariko Oishi1, Suzuna Seko1, Yuri Okada1, Chisato Takahashi1, Keiko Maekawa1 (1. Doshisha Women's College of Liberal Arts)

【目的】Cytochrome P450 2U1(CYP2U1)は、ヒトゲノム解読後にその存在が明らかになったオーファンP450分子種であり、非常に保存されたアミノ酸配列を持ち、ほぼ全ての生物に存在する。CYP2U1は、アラキドン酸を含む不飽和脂肪酸や数種の薬物を代謝することが報告されているが、詳細な基質の情報は不明である。また、CYP2U1の生理学的意義は未解明である。本研究ではCYP2U1の脱オーファン化を目指して基質の探索及び構造上の特性を解明することを目的に、CYP2U1を大腸菌で発現・精製し、脂肪酸を基質とした酵素反応により代謝物を同定した。
【方法】ヒトCYP2U1のN末から59番目までの小胞体膜貫通領域と推定されるアミノ酸を除去して11個のアミノ酸配列で置き換え、C末にHis-tagを付加し、さらに一部のコドンを大腸菌発現用に最適化したcDNAを発現ベクターにクローニングした。本プラスミドを用い、ヒトCYP2U1を分子シャペロンと共に大腸菌BL21株に共発現させ、72時間後に菌体を回収した。菌体破砕液を界面活性剤存在下でNiアフィニティークロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した。アラキドン酸等を基質とした酵素反応をin vitroで行い、液体クロマトグラフィー/質量分析計を用いて代謝物を同定した。
【結果および考察】精製CYP2U1は、CO差スペクトルで450 nmに吸収が認められ、活性を有するホロ酵素であった。本精製酵素はアラキドン酸を酸化部位の異なる数種のhydroxy-eicosatetraenoic acid(HETE)異性体に代謝した。大腸菌でのヒトCYP2U1の大量発現及び基質の探索は、CYP2U1の脱オーファン化に有効と考える。