[VIII-29-10_11] 形態・生理（VIII-午前）

[VIII29-11] 細胞内で活性化したカルパイン3を検出できるのか？

^○尾嶋 孝一¹, 秦 勝志², 大内 史子², 大江 美香¹, 室谷 進¹, 反町 洋之², 小野 弥子² (1.農研機構畜産部門, 2.都医学研)

【目的】カルパインはCa²⁺により活性化するタンパク質分解酵素である．骨格筋特異的に発現するカルパイン3は，その酵素活性不全が骨格筋萎縮･変性を引き起こすことから，骨格筋細胞が正常に機能するために必須である．しかし，活性化したカルパイン3を検出する方法がイムノブロット法に限られていたため，カルパイン3の制御機構を動的に解析するには至っていない．そこで，本研究では活性化したカルパイン3を生きた細胞内で検出するためのプローブを作製することを目的とした．【方法】カルパイン3の酵素活性を検出するために蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の原理を利用した．シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（Venus）の間にカルパイン3により切断されるアミノ酸配列を挿入したセンサープローブを設計した．カルパイン3がセンサープローブを切断するとFRETが解消され， VenusからCFPに蛍光波長が変化することで活性化カルパイン3を検出する．【結果】センサープローブを導入した培養細胞を薬剤処理し，カルパイン3の活性化を誘導し，センサープローブの蛍光波長変化を顕微鏡下でモニターした．その結果，薬剤処理後にセンサープローブの蛍光比（CFP/Venus）が上昇し，蛍光波長変化を捉えることができた．すなわち，細胞内で活性化したカルパイン3を作製したセンサープローブにより検出することに成功した．